I slutningen af 1980'erne, som den avancerede Laser-konfokalmikroskopi har imidlertid en stor defekt: den konfokale apertur blokerer ikke kun fluorescensen, der genereres uden for brændpunktet, men blokerer også fluorescensen, der genereres af brændpunktet, der er spredt af det biologiske væv, hvilket resulterer i et fald i opsamlingseffektiviteten af fluorescens, og billeddybden kan ikke være mere end 100 mikrometer. Derfor opstod i 1990'erne to-foton fluorescensmikroskopi, der kombinerede laser konfokal mikroskopi og to-foton excitationsteknologi. Excitationsbølgelængden af to-foton-absorptionsprocessen er generelt sat i det bio-optiske vinduesområde på 680-1080 nm, hvilket undgår beskadigelse af ultraviolet lys til cellerne eller levende organismer og trænger dybere ind.
I øjeblikket er det mest udbredte to-foton fluorescensmikroskop femtosekund titanium ædelsten laser, som er omfangsrig og dyr, hvilket begrænser anvendelsen af to-foton fluorescens mikroskopi på forskellige områder såsom biovidenskab, kemi og medicin. Så på nogle områder som medicinsk diagnostik har folk forsøgt at bruge kompakte og overkommelige sub-nanosekunders solid-state lasere som standard lyskilde.
Det grundlæggende princip for to-foton excitation er, at når et fluorescerende molekyle exciteres under høj fotondensitet, absorberer det samtidig to langbølgede fotoner og udstråler derefter spontant fluorescerende fotoner tilbage til grundtilstanden efter excitationsspring og afslapningsprocesser. Sammenlignet med konventionel enkeltfoton-excitationsfluorescensmikroskopi er den optiske signalgenerering i to-foton-excitationsfluorescensmikroskopi ikke-lineær, idet excitationslyset er en lyskilde med længere bølgelængde og højere spidseffekt, og de udsendte fluorescerende fotoner har en bølgelængde lidt længere end halvdelen af excitationsbølgelængden.
To-foton fluorescensmikroskopi bruger en nær-infrarød laserlyskilde, og dens ikke-lineære natur kræver ikke en konfokal blænde. Sammenlignet med konfokal mikroskopi har to-foton fluorescensmikroskopi derfor følgende fordele:
- Stor billeddybde og lav optisk skade;
- Der kræves ingen konfokal blænde, og fluorescensopsamlingseffektiviteten er væsentligt forbedret;
- Højere rumlig opløsning og kontrast;
- Lille excitationsområde, lille fototoksicitet og blegning;
- Emissions- og excitationsbølgelængderne er langt fra hinanden, hvilket undgår spektral overlapning;
